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第一代测序技术-Sanger测序

  日期:2014-08-22  浏览:0

DNA测序正处在技术上天翻地覆剧变的阵痛之中,其突出特点是,测序通量(测序数据量)的大幅增长,原始数据中每个碱基的测序成本急剧下跌,并伴随着以巨资购买仪器以引进新技术的需求。以前看似高不可攀的奢侈性研究活动(如个人基因组测序,宏基因组学研究,以及对大量重要物种的测序),在短短几年之间,正以急速的步伐而变得越来越切实可行了。


迄今为止,无论二代测序平台更新的多么迅猛,三代、四代测序技术如何高大上,也没有谁能完全替代第一代的Sanger测序平台。该平台的测序读长可达900bp,准确性高达99.999%,运行一次2小时,最大数据通量为81kb。其测序成本高,通量低等方面的缺点,严重影响了大规模的应用。上个世纪末发起的人类基因组测序计划就是由sanger测序完成的。


1977年,英国人Frederick Sanger 创建了双脱氧链末端合成终止法(chain termination method),简称Sanger法、双脱氧法或酶法。他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP,就会产生一系列末端终止的DNA链,并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。


Sanger双末端终止法测序原理


基本原理是利用DNA聚合酶,以待测单链DNA为模板,以dNTP为底物,设立四种相互独立的测序反应体系,在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP)作为链延伸终止剂。在测序引物引导下,按照碱基配对原则,每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链,通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,放射自显影检测后,从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列,由此推知待测模板链的序列。


Sanger双末端终止法测序流程


在4组相互独立的测序反应体系中,分别加入四种不同ddNTP,其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例,使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。
产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测,直接读出新合成DNA链的序列。


基于Sanger链终止法的DNA自动化测序


1. 毛细管电泳
       毛细管电泳(Capillary electrophoresis, CE)是以高压直流电场为驱动力,在毛细管内使荷电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点。

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2.激光测序法终止标记系统
激光测序法终止标记系统是用4种不同的荧光染料标记不同的ddNTP。测序反应可以在同一反应管内进行,不必分成4管,反应产物按终止位置的碱基不同其3′末端带有不同的荧光基团,被激发后产生不同的荧光,将反应产物加样于凝胶的同一加样孔,电泳分离后,经过DNA测序仪分析系统识别,将检测将信号不断传送到计算机,通过软件分析,自动读出待测DNA的全部核苷酸序列。


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自动化测序测序流程--ABI测序仪(Sanger测序法主要应用于ABI的3730xl 和3130xl测序仪)


荧光标记BigDye Terminators:

美国应用生物系统公司拥有专利四色荧光分别标记的起链终止剂作用的四种ddNTPs,与四个反应管循环测序反应及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比,实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测。由于使用了四色荧光分别标记了四种ddNTPs,可按照四种不同荧光来分别识别A、T、G、C,因此,可在一个反应管中完成循环测序反应,并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点。


测序反应:

利用测序酶和单向测序引物进行。其核心仍然是PCR反应。在测序反应体系中除了一般PCR反应所用的dNTP外,还带有BigDye Terminators。通过反应的随机终止得到一系列含有不同荧光标记的DNA片段。


电泳与结果分析:

染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光谱的四种不同颜色的荧光,同时,测序仪的专用激光扫描镜头实时扫描不同大小的DNA片段在相应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光,将不同大小DNA片段发射的荧光实时地传递给计算机测序数据实时收集软件,将电泳结果转换成胶图文件及原始数据信号。当电泳完毕后,DNA序列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号,得到最终的测序结果。


Sanger测序的应用


Sanger测序仍是目前基因分型的金标准。相对于其他分型技术具有最高的准确性,并能检测新的突变。上个世纪末发起的人类基因组测序计划就是由sanger测序完成的。