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焦磷酸测序技术的原理

  日期:2014-08-29  浏览:1

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术,焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析,其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美,而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力,为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。该技术进行改进后可以满足上百个核苷酸序列的测序工作,这样该技术又可以满足对重要微生物的鉴定与分型,特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。


Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术,可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下:


    第1步:1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合,然后加入酶混合物(包括DNA PolymeraseATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。


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第2步:向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对,则会在DNA聚合酶的作用下,添加到测序引物的3‘末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。


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第3步:在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下,生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素,同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比



第4步:反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解



第5步:加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行,根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。