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单分子测序技术简介

  日期:2014-08-22  浏览:2

单分子测序原理是利用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链,在三围空间中记录模板位置和核苷酸序列信息, 再反向构建DNA模板的序列。除了DNA合成反应的三大要素(模板、酶、核苷酸)之外,模板所处位置和反应循环中单色荧光标记的核苷酸顺序(如A、C、G、T)也是最终DNA序列能够完成的关键要素。如果反应所用的核苷酸标记着四种不同的荧光,则每一次反应循环就需要切换不同波长的光以记录不同的碱基。


1.并行单分子合成测序技术


Helicos Biosciences 是第一个设计开发单分子测序方法( tSMSTM) 技术平台的公司,其基础主要来自于Braslavsky 等人的研究。主要是利用合成测序理论,测序时首先将待测序列打断成小片段并在3'末端加上polyA ,并用末端转移酶阻断,同时在玻璃芯片上随机固定多个polyT引物(其末端皆带有荧光标记),将小片段DNA模板与检测芯片上的polyT引物进行杂交并精确定位,通过成像来精确定位杂交模板所处的位置,建立边合成边测序的位点;逐一加荧光标记的单色末端终止子及聚合酶的混合液孵育,洗涤,利用全内反射显微镜(total internal reflection microscopy,TIRM)进行单色成像,之后切开荧光染料和抑制基团,洗涤,加帽,允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环,就可以实现实时测序。由于该技术采用了Cy5 (吲哚-5-菁) 荧光基团具有很好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率,激发波长在647nm 处)和灵敏的监测系统,能够直接记录到单个碱基的荧光,从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。

2.单分子实时合成测序技术


SMRT 技术是基于边合成边测序的思想,以SMRT芯片为载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多零模式波导孔( zero-mode waveguides,ZMW) ( 厚度为100 nm) 的金属片,ZMW 是一种直径只有几十个纳米的孔,由于其底部上的小孔短于激光的单个波长,导致激光无法直接穿过小孔,而会在小孔处发生光的衍射,形成局部发光的区域,即为荧光信号检测区,该区域内锚定有DNA 聚合酶。测序时将基因组的DNA 打断成许多小的片段,制成液滴后将其分散到不同的ZMW 纳米孔中。当ZMW 孔底部聚合反应发生时,被不同荧光标记的核苷酸会在小孔的荧光探测区域中被聚合酶滞留数十毫秒,荧光标记会在激光束( Excitation) 的激发下发出荧光,根据荧光的种类就可以判定dNTP 的种类,反应完成后荧光标记会被聚合酶切除而弥散出ZMW 小孔,其它未参与合成的dNTP 由于没进入荧光信号检测区而不进入荧光信号检测区。SMRT 测序时,样品准备过程涉及到样品DNA 的打断、末端补齐、连接接头、测序这几个步骤。测序中需要的样品量很少,样品准备中所用的试剂也很少,而且测序过程中省去扫描和洗涤的过程,所以测序所花的时间较少。

3.纳米孔单分子技术


Oxford Nanopore Technologies 公司研发的测序技术完全不同于前两种测序技术,其核心就是将在某一面上含有一对电极的特殊的脂质双分子层置于一个微孔之上,该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔中结合一个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时,孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA 分子,顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基,每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断,根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类,最终得DNA分子的序列。纳米孔单分子测序技术的一大优势就是仪器构造简单使用成本低廉;因为它不需要对核苷酸进行标记,也不需要复杂的光学探测系统(如激光发射器和CCD信号采集系统等),能直接对RNA分子进行测序。同时由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流,因而能对修饰过的碱基进行测序,这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值;缺点就是它采用的是水解测序法,不能进行重复测序,因而无法达到一个满意的测序精确度。