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CRISPR基因编辑结果全靠猜?No,部分可预测

  日期:2018-12-18  来源:生物通




CRISPR-Cas9系统已成功用于多个生物的基因组编辑,然而,我们还不能很好地预测特定位点上的编辑结果。为此,英国弗朗西斯•克里克研究所的研究人员对近1,500个目标位点上的编辑结果进行系统分析,发现各个位点之间的编辑精确性差异很大。  


CRISPR-Cas9系统已成功用于多个生物的基因组编辑,然而,我们还不能很好地预测特定位点上的编辑结果。为此,英国弗朗西斯•克里克研究所的研究人员对近1,500个目标位点上的编辑结果进行系统分析,发现各个位点之间的编辑精确性差异很大。


研究人员发现,编辑精确性与编辑效率相关,并且可根据某些简单的规则来预测编辑结果,如PAM序列上游的第四个核苷酸。他们还发现,插入缺失的图谱受染色质特征的影响。这项结果近日发表在《Molecular Cell》上。


“到目前为止,CRISPR对基因的编辑还伴随着不少猜测和试错,”资深作者Paola Scaffidi说。“人们一度认为,CRISPR的结果是随机的、无法预测的,不过在分析了数百个编辑之后,我们惊讶地发现这背后其实有着可预测的简单模式。这将彻底改变我们使用CRISPR的方式,让我们更精确地研究基因功能。”


为了鉴定Cas9核酸酶诱导的插入缺失的一般模式,研究人员选择了450个核基因上的1,491个位点,并利用多个sgRNA来介导编辑。对于每个基因,他们至少选择了三个位点。总共有1,248个位点出现了可检测的插入缺失。


研究人员又观察了一些常见的编辑模式。对大多数的目标而言,单核苷酸插入缺失是最常见的插入缺失形式,其中44%的位点表现出单核苷酸插入,而26%的位点表现出单核苷酸缺失。不过,某些位点也倾向于更长的缺失,如长达41个核苷酸。


同时,他们还发现CRISPR诱导的插入缺失往往会导致移码突变。平均而言,80.1%的插入缺失破坏了基因编码框。不过,有三个位点更倾向于产生符合读框(in-frame)的插入缺失,这表明针对它们的基因敲除可能难以成功。


接下来,研究人员根据插入缺失的模式开展分层聚类分析,将这些目标位点分成四组,包括倾向于小的插入、小的缺失、长的缺失的位点,以及无明显倾向的位点。他们还发现sgRNA的活性是高度可变的,而插入缺失的数量与混合物中的sgRNA丰度不相关。


“不同的目标位点表现出不同的倾向,这促使我们去研究各个位点的编辑精确程度,”作者在文中写道。“这一分析表明编辑精确性差异很大,某些位点显示出79个不同的插入缺失,而某些位点只有一个主要的插入缺失。总体而言,对于约五分之一的目标位点,人们至少有50%的机会诱导出特定的插入缺失,而大多数位点更难以预测。”


后续的分析表明编辑精确性与编辑效率、插入缺失类型和插入缺失大小相关。他们还观察到某些DNA序列对编辑精确性有明显的影响。具体来说,PAM序列上游的第四个核苷酸对编辑精确性具有最强的影响。PAM上游的第二个、第三个和第五个核苷酸也有作用,不过比第四个核苷酸要弱。


研究人员总结道,编辑精确性是位点特异性的,并且可以预测的,这具有重要的意义。“实际上,了解特定位点可能发生哪些编辑结果,能够最大限度获得理想的序列改变,适用于临床和科研应用,”他们谈道。



参考资料:

Target-Specific Precision of CRISPR-Mediated Genome Editing





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